一种电化学免疫检测方法

日期:2019-03-02 15:11:39

专利名称:一种电化学免疫检测方法
技术领域
本发明涉及电化学免疫领域,特别涉及一种基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学免疫检测方法。
背景技术
原发性肝癌(primary carcinoma of the liver)是我国常见恶性肿瘤之一。死亡率高,在恶性肿瘤致死率中仅次于胃癌、食道癌居第三位,在部份地区的农村中则占第二位,仅次于胃癌。我国每年死于肝癌约11万人,占全世界肝癌死亡人数的45%。因此,对原发性肝癌进行早期诊断、制定合理治疗方案及评估疗效尤为重要。目前用于原发性肝癌辅助诊断的主要方法有胸片、CT、以及痰细胞学检查等,而血清肿瘤标志物的检测由于取样简单、易于接受等特点,在肿瘤筛查、诊断、评价治疗疗效等方面具有较大的实用价值。血清甲胎蛋白(AFP)是胚胎时期肝细胞合成的一种特殊的糖蛋白,胎儿血清中含量较高,出生1 2周后含量已不易测到,故正常成人血清中用一般方法测不到甲胎蛋白 (AFP)。因此,甲胎蛋白(AFP)可以作为原发性肝癌血清学诊断的指标。但部分患者会检出假阳性或假阴性,结合新的肿瘤标志物对于提高原发性肝癌的检出率具有重要意义。异常凝血酶原是除甲胎蛋白外公认的有效肝癌标志物,在肝癌的诊断、预后和疗效监测上都有一定价值。凝血酶原是由肝脏合成的依赖维生素K的凝血因子,异常凝血酶原(Abnormal Prothrombin, APT)和凝血酶原的化学结构极其相似,区别在于异常凝血酶原(APT)分子氨基端的特定位置上的谷氨酸残基未经羧基化,因而缺乏结合钙离子的结构基础,在一般凝血试验中无凝血活性。自从1984年Liebman等观察到原发性肝癌患者血浆异常凝血酶原(APT)水平显著升高,异常凝血酶原(APT)与肝癌的关系引起研究者的关注。虽然APT轻度升高亦可见于维生素K缺乏,但在注射维生素K后即可得到纠正,故并不影响对原发性肝癌的诊断。因此,异常凝血酶原(APT)作为原发性肝癌的肿瘤标志物越来越受到重视,尤其在甲胎蛋白(AFP)不升高者或低度升高者体内,异常凝血酶原(APT)往往升高,对这类原发性肝癌病人的诊断更有价值。目前,国内外采用酶联免疫方法测定异常凝血酶原(APT)已处于临床应用阶段。由于酶联免疫法灵敏度不高,不易检测出痕量异常凝血酶原(APT),影响对原发性肝癌检测的准确性。电化学发光(ECL)是通过在电极上施加一定波形的电压或电流信号,进行电解反应的产物之间或与体系中共存组分反应产生化学发光的现象。电化学发光(ECL)与化学发光(CL)的差异在于,电化学发光(ECL)是电启动发光反应,而化学发光(CL)是通过化合物混合启动发光反应。因此,电化学发光(ECL)反应易精确控制,具有灵活性和稳定性。电化学发光免疫分析(Electro-Chemiluminescence Immunoassay, ECLI)是电化学发光和免疫测定相结合的产物。在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应,用标记物标记抗体, 通过抗原与抗体的特异性反应,根据电极上发出的光强度对待测的抗原或抗体进行定性、 定量分析,兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性。电化学免疫分析的标记物主要有两类生物酶及电化学活性物质。用作标记物的电化学活性物质为具有电化学
3氧化还原性质的金属离子和电活性的有机功能基团。纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1 IOOnm)或由它们作为基本单元构成的材料,这大约相当于10 100个原子紧密排列在一起的尺度。由于纳米材料具有的高比表面积、高活性、特殊物理性质及小尺寸,使得纳米材料从一个惰性体转变为一个活泼的能提供电子和获取电子的物体,将其引入传感器的构建中可明显增强传感器的响应速度、灵敏度、选择性等。因此,提供一种灵敏度高、特异性好的基于复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法用来检测异常凝血酶原(APT),对原发性肝癌的早期诊断、病情监测、判断预后及其制定合理的治疗方案和评估疗效具有重要意义。

发明内容
有鉴于此,本发明提供一种基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学免疫检测方法。该检测方法采用双抗体夹心法,使固载在电极表面的异常凝血酶原抗体与样品溶液中的异常凝血酶原发生免疫反应,再和纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与异常凝血酶原抗体共耦合物结合。基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学活性,测得的循环伏安还原峰峰电流值与异常凝血酶原浓度呈正相关,进而检测检测样品中异常凝血酶原的浓度。为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案本发明提供了一种纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物的制备方法,将硫堇加入石墨烯水溶液中,超声处理,制得硫堇-石墨烯复合物;将所述硫堇-石墨烯复合物加入到壳聚糖溶液中,制得壳聚糖包裹的硫堇-石墨烯纳米颗粒;将所述壳聚糖包裹的硫堇-石墨烯纳米颗粒在水中超声分散,与HPtCl6混合后加入水中,再逐滴加入NaBH4 做还原剂,反应后离心收集沉淀,制得所述纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物。石墨是由一层层以蜂窝状有序排列的平面碳原子堆叠而形成的,石墨的层间作用力较弱,很容易互相剥离,形成薄薄的石墨片。当把石墨片剥成单层之后,这种只有一个碳原子厚度的单层就是石墨烯。石墨烯不仅是一直材料中最薄的一种,而且非常坚固坚硬;石墨烯是一种二维晶体,最大的特性是其中导电电子不仅能在晶格中无障碍地移动,而且速度极快,到了光速的1/300,远远超过了电子在金属导体或半导体中的移动速度。硫堇(Thi)是一种平面刚性芳环结构的噻吩类小分子化合物,具有良好的氧化还原电化学活性,同时其具有两个氨基,可以通过共价结合和静电作用吸附纳米颗粒,应用于生物传感器中。壳聚糖(chitosan,CS)含有丰富的亲水性氨基和羟基,并且不溶于水和碱溶液。 凭借易成膜、化学惰性、无毒、低成本和良好的生物相容性被化学修饰电极和生物传感器的研究。纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1 IOOnm)或由它们作为基本单元构成的材料,这大约相当于10 100个原子紧密排列在一起的尺度。纳米材料所具有的高比表面积、高活性、特殊物理性质及小尺寸等特性使之成为非常有前景的传感器制备材料。由于纳米材料具有的大比表面、高表面,这使得纳米材料从一个惰性体转变为一个活泼的能提供电子和获取电子的物体,将其引入传感器的构建中,可明显增强传
4感器的响应速度、灵敏度、选择性等。纳米材料因具有良好的吸附能力、表面效应、小尺寸效应、量子效应和宏观量子隧道效应等特点已广泛应用到到电化学免疫传感器中,作为生物活性的载体。纳米钼所采用的原料为钼金(platinum)金属单质,元素符号为Pt,与金银一起统称为贵金属元素,硬度为4 4. 5度,相对密度为21. 45,比重为15 19或21. 4,延展性强, 耐熔、耐摩擦、耐腐蚀,在高温下化学性质稳定。纳米钼的粒径大小为1 3nm,因此大大提高了钼金固有的性能,如催化效果、分散效果、去除自由基效果等。基于石墨烯良好的导电性,硫堇分子的氧化还原电化学活性,壳聚糖具有丰富的氨基和良好的生物相容性等特点,本发明将石墨烯与硫堇制得纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物。本发明还提供了上述制备方法制得的纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物。作为优选,本发明提供的一种纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物的制备方法,包含如下步骤步骤1 将5mg硫堇加入4. 5mL质量分数为0. 05%的石墨烯水溶液,在20°C下持续超声4h,用乙醇和去离子水分别离心洗涤,除去未与石墨烯结合的硫堇,制得硫堇-石墨烯复合物;步骤2 将所述硫堇-石墨烯复合物加入到5. 5mL 10mg/mL的壳聚糖溶液中,60°C 连续搅拌12h,逐滴加入30 μ L 0. lmol/L的醋酸,室温下搅拌lOmin,在90°C的油浴中持续加热lh,用0. 2-0. 26- μ m的尼龙膜过滤,制得壳聚糖包裹的硫堇_石墨烯纳米颗粒;步骤3 将所述壳聚糖包裹的硫堇-石墨烯纳米颗粒在水中超声分散,取5mg与 80-150 μ L质量分数为的HPtCl6混合均勻后加入到IOmL水中,剧烈搅拌5min,逐滴加入0. 25mL 1 OOmmo 1/L的NaBH4,搅拌30min后,8000rpm离心lOmin,制得所述纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物。本发明还提供了一种电化学免疫检测方法,包括如下步骤步骤1 将纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与PBS混勻,再加入辣根过氧化物酶标记的待测蛋白抗体,离心收集沉淀,用封闭液温育,制得所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的待测蛋白抗体共耦合物;步骤2 将玻碳电极抛光成镜面,超声清洗,置于氯金酸溶液中,恒电位沉积,用二次水冲洗干净,置于待测蛋白抗体溶液中,封闭液温育,制得免疫电极;将所述免疫电极与含有不同浓度待检蛋白的标准品温育,置于所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的待测蛋白抗体共耦合物中温育,制得工作电极;以所述工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极作为参比电极的三电极体系中,采用线性扫描伏安法进行电化学检测,以工作电极和免疫电极的响应电流值之差和标准品中待检蛋白的浓度绘制标准曲线;步骤3 如步骤2,将所述免疫电极与待测样品温育,进行电化学发光测试,测得待测样品的电化学峰峰电流强度,从标准曲线上读取对应的待检蛋白的浓度。作为优选,为了除去非特异性结合位点,本发明采用封闭液牛血清白蛋白。作为优选,为了保证充分结合,本发明选用温育的温度为20 40°C。
作为优选,为了保证充分结合,本发明选用温育的时间为40 120min。作为优选,所述缓冲液为含有H2A的pH值为5 6的醋酸缓冲溶液。作为优选,所述线性扫描伏安法,电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 6 0. 2V。作为优选,所述待检蛋白为肿瘤标志蛋白。肿瘤标志物(Tumor Marker)由肿瘤组织自身产生,可反映肿瘤存在和生长的一类生化物质,它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织,或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量,它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质,借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能,以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。主要有胚胎抗原、糖类抗原、天然自身抗原、细胞角蛋白、肿瘤相关的酶、激素以及某些癌基因等。肿瘤标志蛋白是由肿瘤组织自身产生,可反映肿瘤存在和生长的蛋白类物质。电化学免疫分析法(Electrochemical Immunoassay, ECIA)是将免疫技术与电化学检测结合的一种免疫分析新方法,基于抗原和抗体的特异性反应,将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上,通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量,兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性。因此,本发明提供的电化学检测方法可以通过抗原抗体的特异性反应,用来检测肿瘤标志蛋白。优选地,所述肿瘤标志蛋白包括胃泌素前体释放肽、神经元特异性烯醇化酶、 CYFRA21-1、AFP、异常凝血酶原、CEA、CA242、CA125、CA199、CA153、CA724、CA50、f-PSA、 t-PSA、Free β-hCG、SCCA, β2-MG。肿瘤标志蛋白按照肿瘤组织产生不同,包括分化抗原;胚胎抗原(AFP,CEA);同工酶(NSE);激素(HCG);组织特异性抗原(PSA,free PSA);粘蛋白、糖蛋白、糖脂(CA125);电化学发光仪上常可检验一下标志物AFP、CEA、CA199、CA724、CA125、CA153、NSE、Cyfra21-l、 PSA、free PSA。优选地,所述待检蛋白为异常凝血酶原。作为优选,本发明提供了一种电化学免疫检测方法,包括如下步骤步骤1 纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物的制备25mg/mL纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇_石墨烯纳米复合物2. OmL与IOmL PBS混勻,加入质量体积比为10% (g/mL)的K2CO3,调节pH值至9. 5,加入500ng/mL的辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体400-500 μ L,轻微搅拌, 4°C孵育12h,8000rpm离心分离lOmin,用0. 25%的BSA溶液进行封闭,保存于4°C pH值为 7. 0的PBS溶液中,制得所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物;步骤2:将玻碳电极(Φ = 4mm)抛光成镜面,超声清洗,晾干,置于1 %的氯金酸(HAuCl4)溶液中,在-0. 2V下恒电位沉积30-50s,取出,用二次水冲洗干净,晾干,置于 0. 5-1.0 μ g/mL异常凝血酶原抗体溶液中,于4°C浸泡吸附8h,置于0. 25% BSA溶液中, 37°C温育lh,取出,水洗,制得免疫电极;将所述免疫电极与80-120 μ L的异常凝血酶原, 于37°C反应25min,用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品,置于80-120 μ L所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物中,37°C下反应25min,用PBS溶液洗,以除去非特异性吸咐的所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物,制得工作电极;以所述工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极作为参比电极的三电极体系,在含有2. 0 3. Om mol/L的H2R的0. lmol/L醋酸缓冲溶液(pH = 5 6)中进行,中采用线性扫描伏安法进行电化学检测,以工作电极和免疫电极的响应电流值之差和标准品中待检蛋白的浓度绘制标准曲线,电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 6 0. 2V ;步骤3 如步骤2,将所述免疫电极与待检样品混合温育,进行电化学检测,测得待测样品的电化学峰峰电流强度,从标准曲线上读取对应的待检蛋白的浓度。本发明提出一种以纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物。应用该纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物能够方便制备夹心免疫分析方法中的检测抗体。基于石墨烯良好的导电性,硫堇分子的氧化还原电化学活性,壳聚糖具有丰富的氨基和良好的生物相容性等特点,纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物能有效固载大量辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体,同时增强酶活性中心电子的传输速率,从而增强电极响应信号,提高了免疫传感器灵敏度。本发明提供的电化学免疫检测方法线性响应范围为0. 8 800ng/mL,检测下限为0. 23ng/mL,特异性好,灵敏度高,对异常凝血酶原(APT)的诊断具有重要意义。


图1示实施例4基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学免疫检测方法制得的异常凝血酶原(APT)标准曲线,横坐标为异常凝血酶原(APT)标准品的浓度,单位为ng/mL ;纵坐标为检测得到峰电流均值,单位为μ A。图2示实施例5基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学免疫检测方法制得的异常凝血酶原(APT)标准曲线,横坐标为异常凝血酶原(APT)标准品的浓度,单位为ng/mL ;纵坐标为检测得到峰电流均值,单位为μ A。图3示实施例6基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学免疫检测方法制得的异常凝血酶原(APT)标准曲线,横坐标为异常凝血酶原(APT)标准品的浓度,单位为ng/mL ;纵坐标为检测得到峰电流均值,单位为μ A。
具体实施例方式本发明公开了一种基于上述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学免疫检测方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。下面结合实施例,进一步阐述本发明本发明中,硫堇、壳聚糖、HPtCl6,异常凝血酶原(APT)、异常凝血酶原抗体 (anti-APT)、辣根过氧化物酶标记异常凝血酶原抗体(HRP-anti-APT)均购自美国Sigma公司;石墨烯购自南京先锋纳米材料科技有限公司;人体血清样品均来自第三军医大学第三附属医院肿瘤中心,检测组(患者血清)216名,其中男108名,女108名;对照组(正常人血清)100名,其中男50名,女50名。实施例1纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物的制备将5mg硫堇加入4. 5mL质量分数为0. 05%的石墨烯水溶液,在20°C下持续超声 4h,用乙醇和去离子水分别离心洗涤,除去未与石墨烯结合的硫堇,制得硫堇-石墨烯复合物;将所述硫堇-石墨烯复合物加入到5. 5mL 10mg/mL的壳聚糖溶液中,60°C连续搅拌 12h,逐滴加入30 μ L 0. lmol/L的醋酸,室温下搅拌lOmin,在90°C的油浴中持续加热lh,用 0. 2 μ m的尼龙膜过滤,制得壳聚糖包裹的硫堇-石墨烯纳米颗粒;将所述壳聚糖包裹的硫堇-石墨烯纳米颗粒在水中超声分散,取5mg与80 μ L质量分数为1 %的HPtCl6混合均勻后加入到IOmL水中,剧烈搅拌5min,逐滴加入0. 25mL 1 OOmmo 1/L的NaBH4,搅拌30min后, SOOOrpm离心lOmin,制得所述纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物。实施例2纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物的制备将5mg硫堇加入4. 5mL质量分数为0. 05%的石墨烯水溶液,在20°C下持续超声 4h,用乙醇和去离子水分别离心洗涤,除去未与石墨烯结合的硫堇,制得硫堇-石墨烯复合物;将所述硫堇-石墨烯复合物加入到5. 5mL 10mg/mL的壳聚糖溶液中,60°C连续搅拌 12h,逐滴加入30 μ L 0. lmol/L的醋酸,室温下搅拌lOmin,在90°C的油浴中持续加热lh,用 0. 26 μ m的尼龙膜过滤,制得壳聚糖包裹的硫堇-石墨烯纳米颗粒;将所述壳聚糖包裹的硫堇-石墨烯纳米颗粒在水中超声分散,取5mg与120 μ L质量分数为1 %的HPtCl6混合均勻后加入到IOmL水中,剧烈搅拌5min,逐滴加入0. 25mL IOOmmo 1/L的NaBH4,搅拌30min后, SOOOrpm离心lOmin,制得所述纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物。实施例3纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物的制备将5mg硫堇加入4. 5mL质量分数为0. 05%的石墨烯水溶液,在20°C下持续超声 4h,用乙醇和去离子水分别离心洗涤,除去未与石墨烯结合的硫堇,制得硫堇-石墨烯复合物;将所述硫堇-石墨烯复合物加入到5. 5mL 10mg/mL的壳聚糖溶液中,60°C连续搅拌 12h,逐滴加入30 μ L 0. lmol/L的醋酸,室温下搅拌lOmin,在90°C的油浴中持续加热lh,用 0. 22 μ m的尼龙膜过滤,制得壳聚糖包裹的硫堇-石墨烯纳米颗粒;将所述壳聚糖包裹的硫堇-石墨烯纳米颗粒在水中超声分散,取5mg与150 μ L质量分数为1 %的HPtCl6混合均勻后加入到IOmL水中,剧烈搅拌5min,逐滴加入0. 25mL IOOmmo 1/L的NaBH4,搅拌30min后, SOOOrpm离心lOmin,制得所述纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物。实施例4基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学检测方法检测异常凝血酶原(APT)纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与异常凝血酶原抗体共耦合物的制备25mg/mL实施例1制备的纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物 2. OmL分别与IOmL PBS混勻,加入单位为g/mL的质量体积比为10%的K2CO3,调节pH值至 9. 5,加入500ng/mL的辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体400 μ L,轻微搅拌,4°C孵育iai,8000rpm离心分离lOmin,用0. 25%的BSA溶液进行封闭,保存于4°C pH值为7. O的 PBS溶液中,制得所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物;免疫电极的制备将玻碳电极(Φ = 4mm)抛光成镜面,超声清洗,晾干,置于1 %
8的氯金酸(HAuCl4)溶液中,在-0. 2V下恒电位沉积30s,取出,用二次水冲洗干净,晾干,置于0. 5 μ g/mL异常凝血酶原抗体溶液中,于4°C浸泡吸附8h,置于0. 25% BSA溶液中,37°C 温育lh,取出,水洗,制得免疫电极;工作电极的制备将所述免疫电极与80 μ L的异常凝血酶原,于37°C反应25min, 用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品,置于80 μ L所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物中,37°C下反应25min, 用PBS溶液洗,以除去非特异性吸咐的所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物,制得工作电极;电化学检测采用三电极体系,所述工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,在在含有2. Ommol/L的H2O2的0. lmol/L醋酸缓冲溶液(pH = 5) 中,进行电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学检测。进行三次循环伏安扫描,记录下三次扫描得到的还原峰电流值。测得的循环伏安还原峰峰电流值随异常凝血酶原(APT)的浓度增加而增强,电流变化与异常凝血酶原(APT)成正比。以异常凝血酶原(APT)标准溶液的浓度为横坐标,将三次循环伏安扫描得到的以工作电极和免疫电极的还原峰电流值之差求平均值作纵坐标,制作标准曲线,如图1,标准曲线方程为 I = 5. 210LogCAPT+0. 157。基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与异常凝血酶原抗体共耦合物的电化学免疫检测方法检测人血清样品中异常凝血酶原(APT)人体血清样品均来自第三军医大学第三附属医院肿瘤中心,检测组(患者血清)216名,其中男108名,女108名;对照组(正常人血清)100名,其中男50名,女50名。将制备好的免疫电极分别与80 μ L血清样品溶液,于37V反应25min,用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品,置于80 μ L纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与异常凝血酶原抗体共耦合物溶液中,在37°C下反应25min,用PBS溶液洗3次,以除去非特异性吸咐的共耦合物。电化学检测采用三电极体系,免疫电极为工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,在含有3. Ommol/L的H2A的0. lmol/L醋酸缓冲溶液(PH = 6)中进行,采用电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学对免疫电极进行三次循环伏安扫描,并记录下三次扫描得到的还原峰电流值,并与标准曲线比较,得到对应的异常凝血酶原(APT)的浓度。实施例5基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学检测方法检测异常凝血酶原(APT)纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与异常凝血酶原抗体共耦合物的制备25mg/mL实施例2制备的纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物 2. OmL分别与IOmL PBS混勻,加入质量体积比为10% (g/mL)的K2CO3,调节pH值至9. 5,加入500ng/mL的辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体450 μ L,轻微搅拌,4°C孵育12h, 8000rpm离心分离lOmin,用0. 25%的BSA溶液进行封闭,保存于4°C pH值为7. 0的PBS溶液中,制得所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物;免疫电极的制备将玻碳电极(Φ = 4mm)抛光成镜面,超声清洗,晾干,置于1 % 的氯金酸(HAuCl4)溶液中,在-0. 2V下恒电位沉积40s,取出,用二次水冲洗干净,晾干,置于1. 0 μ g/mL异常凝血酶原抗体溶液中,于4°C浸泡吸附8h,置于0. 25% BSA溶液中,37°C 温育lh,取出,水洗,制得免疫电极;工作电极的制备将所述免疫电极与100μ L的异常凝血酶原,于37°C反应25min, 用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品,置于100 μ L所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物中,37°C下反应25min, 用PBS溶液洗,以除去非特异性吸咐的所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物,制得工作电极;电化学检测采用三电极体系,所述工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,在在含有2. 5mmol/L的H2A的0. lmol/L醋酸缓冲溶液(pH = 5. 8) 中,进行电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学检测。进行三次循环伏安扫描,记录下三次扫描得到的还原峰电流值。测得的循环伏安还原峰峰电流值随异常凝血酶原(APT)的浓度增加而增强,电流变化与异常凝血酶原(APT)成正比。以异常凝血酶原(APT)标准溶液的浓度为横坐标,将三次循环伏安扫描得到的以工作电极和免疫电极的还原峰电流值之差求平均值作纵坐标,制作标准曲线,如图2,标准曲线方程为 I = 5. 276LogCAPT+0. 135。基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与异常凝血酶原抗体共耦合物的电化学免疫检测方法检测人血清样品中异常凝血酶原(APT)人体血清样品均来自第三军医大学第三附属医院肿瘤中心,检测组(患者血清)216名,其中男108名,女108名;对照组(正常人血清)100名,其中男50名,女50名。将制备好的免疫电极分别与100 μ L血清样品溶液,于37°C反应25min,用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品,置于100 μ L纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与异常凝血酶原抗体共耦合物溶液中,在37°C下反应25min,用PBS溶液洗3次,以除去非特异性吸咐的共耦合物。电化学检测采用三电极体系,免疫电极为工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,在含有2. 5mmol/L的H2A的0. lmol/L醋酸缓冲溶液(PH = 5. 4)中进行,采用电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学对免疫电极进行三次循环伏安扫描,并记录下三次扫描得到的还原峰电流值, 并与标准曲线比较,得到对应的异常凝血酶原(APT)的浓度。实施例6基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学检测方法检测异常凝血酶原(APT)纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与异常凝血酶原抗体共耦合物的制备25mg/mL实施例3制备的纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物 2. OmL分别与IOmL PBS混勻,加入质量体积比为10% (g/mL)的K2CO3,调节pH值至9. 5,加入500ng/mL的辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体500 μ L,轻微搅拌,4°C孵育12h, 8000rpm离心分离lOmin,用0. 25%的BSA溶液进行封闭,保存于4°C pH值为7. 0的PBS溶液中,制得所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物;免疫电极的制备将玻碳电极(Φ = 4mm)抛光成镜面,超声清洗,晾干,置于1 % 的氯金酸(HAuCl4)溶液中,在-0. 2V下恒电位沉积50s,取出,用二次水冲洗干净,晾干,置于0. 75 μ g/mL异常凝血酶原抗体溶液中,于4°C浸泡吸附他,置于0. 25% BSA溶液中,37°C温育lh,取出,水洗,制得免疫电极;工作电极的制备将所述免疫电极与120μ L的异常凝血酶原,于37°C反应25min, 用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品,置于120 μ L所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物中,37°C下反应25min, 用PBS溶液洗,以除去非特异性吸咐的所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的异常凝血酶原抗体共耦合物,制得工作电极;电化学检测采用三电极体系,所述工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,在含有2. 8mmol/L的H2O2的0. lmol/L醋酸缓冲溶液(pH = 6)中, 进行电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学检测。进行三次循环伏安扫描,记录下三次扫描得到的还原峰电流值。测得的循环伏安还原峰峰电流值随异常凝血酶原(APT)的浓度增加而增强,电流变化与异常凝血酶原(APT)成正比。以异常凝血酶原(APT)标准溶液的浓度为横坐标,将三次循环伏安扫描得到的以工作电极和免疫电极的还原峰电流值之差求平均值作纵坐标,制作标准曲线,如图3,标准曲线方程为I = 5. 04LogCAPT+0. 522。基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与异常凝血酶原抗体共耦合物的电化学免疫检测方法检测人血清样品中异常凝血酶原(APT)人体血清样品均来自第三军医大学第三附属医院肿瘤中心,检测组(患者血清)216名,其中男108名,女108名;对照组(正常人血清)100名,其中男50名,女50名。将制备好的免疫电极分别与120 μ L血清样品溶液,于37°C反应25min,用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品,置于120 μ L纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与异常凝血酶原抗体共耦合物溶液中,在37°C下反应25min,用PBS溶液洗3次,以除去非特异性吸咐的共耦合物。电化学检测采用三电极体系,免疫电极为工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,在含有2. 2mmol/L的H2A的0. lmol/L醋酸缓冲溶液(PH = 5. 2)中进行,采用电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学对免疫电极进行三次循环伏安扫描,并记录下三次扫描得到的还原峰电流值, 并与标准曲线比较,得到对应的异常凝血酶原(APT)的浓度。实施例7基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学免疫检测方法与ELISA检测方法的比较人体血清样品均来自第三军医大学第三附属医院肿瘤中心,检测组(患者血清)216名,其中男108名,女108名;对照组(正常人血清)100名,其中男50名,女50名。ELISA检测异常凝血酶原(APT) :ELISA试剂盒购自上海锐谷生物科技有限公司。与实施例4至6中基于纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学免疫检测方法的检测结果比较,血清样品为检测组患者血清,共216个样本,其中男性患者108名,女性患者108名,平均分为18组,每组血清样本6个,男性女性血清样本各3个, 结果见表1。表1电化学免疫检测方法与ELISA检测方法的结果
权利要求
1.本发明提供一种纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物的制备方法, 其特征在于,将硫堇加入石墨烯水溶液中,超声处理制得硫堇-石墨烯复合物;将所述硫堇-石墨烯复合物加入到壳聚糖溶液中,制得壳聚糖包裹的硫堇-石墨烯纳米颗粒;将所述壳聚糖包裹的硫堇-石墨烯纳米颗粒超声分散,与HPtCl6混合后,逐滴加入NaBH4还原制得所述纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物。
2.如权利要求1所述的制备方法制得的纳米钼壳聚糖双重包裹硫堇-石墨烯的纳米复合物。
3.一种电化学免疫检测方法,其特征在于,包括如下步骤步骤1 制备如权利要求2所述的纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的待测蛋白抗体共耦合物;步骤2:将玻碳电极预处理后置于待测蛋白抗体溶液中充分结合,封闭以去掉非特异性结合位点,制得免疫电极;将所述免疫电极与含有不同浓度待检蛋白的标准品充分结合, 置于所述纳米钼壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与辣根过氧化物酶标记的待测蛋白抗体共耦合物中充分结合,制得工作电极;采用线性扫描伏安法进行电化学检测,以工作电极和免疫电极的响应电流值之差和标准品中待检蛋白的浓度绘制标准曲线;步骤3 如步骤2,将所述免疫电极与待测样品温育,进行电化学发光测试,测得待测样品的电化学峰峰电流强度,从标准曲线上读取对应的待检蛋白的浓度。
4.如权利要求3所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,所述玻碳电极预处理包括将所述玻碳电极抛光成镜面,超声处理后置于氯金酸溶液中,恒电位沉积。
5.如权利要求3所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,所述缓冲液为含有H2A的 PH值为5 6的醋酸缓冲溶液。
6.如权利要求3所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,所述线性扫描伏安法,电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 6 0. 2V。
7.如权利要求1至6任一项所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,所述待检蛋白为肿瘤标志蛋白。
8.如权利要求7所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,所述肿瘤标志蛋白包括胃泌素前体释放肽、神经元特异性烯醇化酶、CYFRA21-1、AFP、异常凝血酶原、CEA、CA242, CA125、CA199、CA153、CA724、CA50、f-PSA、t_PSA、Free β -hCG、SCCA, β 2-MG。
9.如权利要求8所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,所述待检蛋白为异常凝血酶原。
全文摘要
本发明公开一种基于纳米铂壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学免疫检测方法。该检测方法采用双抗体夹心法,使固载在电极表面的异常凝血酶原(APT)抗体与样品溶液中的异常凝血酶原(APT)发生免疫反应,再和纳米铂壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物与异常凝血酶原(APT)抗体共耦合物结合。基于纳米铂壳聚糖双重包裹的硫堇-石墨烯纳米复合物的电化学活性,测得循环伏安还原峰峰电流值进而检测检测样品中异常凝血酶原的浓度。本发明提供的电化学免疫检测方法线性响应范围为0.8~800ng/ml,检测下限为0.23ng/ml,特异性好,灵敏度高,对异常凝血酶原(APT)的诊断具有重要意义。
文档编号B82Y40/00GK102226779SQ20111007584
公开日2011年10月26日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者仲召阳, 关伟, 单锦露, 卿毅, 戴楠, 李梦侠, 王东 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院


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