基于Au-PB-SiO<sub>2</sub>复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法

日期:2019-03-02 15:11:44

专利名称:基于Au-PB-SiO<sub>2</sub>复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法
技术领域
本发明涉及电化学免疫领域,特别涉及一种基于Au-PB-SiO2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法。
背景技术
肺癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率居全球首位,并呈逐年增多的趋势。小细胞肺癌(small-cell lung cancer, SCLC)是恶性程度最高的肺癌,占所有肺癌病例的15 20%。肿瘤细胞具有分化程度低、倍增时间短、分裂指数高、早期易出现远处转移等特异的生物学行为,对放疗和化疗高度敏感,多数患者病情发展快,短期内死亡,因此,对小细胞肺癌进行早期诊断、制定合理治疗方案及评估疗效尤为重要。目前用于肺癌辅助诊断的主要方法有胸片、CT、以及痰细胞学检查等,而血清肿瘤标志物的检测由于取样简单、易于接受等特点,在肿瘤筛查、诊断、评价治疗疗效等方面具有较大的实用价值。神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)是参与糖酵解途径的烯醇化酶中的一种,是神经内分泌细胞特有的一种酸性蛋白酶,存在于神经组织和神经内分泌组织中,在脑组织细胞的活性最高,外周神经和神经分泌组织的活性水平居中,最低值见于非神经组织、血清和脊髓液。它被发现在与神经内分泌组织起源有关的肿瘤中,特别是小细胞肺癌(SCLC)中有过量的神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达,导致血清中NSE明显升高,是小细胞肺癌、神经母细胞瘤和恶性黑色素瘤的标志物,再加上血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)水平与小细胞肺癌(SCLC)的临床分期呈正相关,因此,血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)检测对小细胞肺癌(SCLC)的监测病情、疗效评价及预测复发具有重要的临床价值。目前,国内外采用酶联免疫方法测定神经元特异性烯醇化酶(NSE)已处于临床应用阶段,但是酶联免疫法灵敏度不高,不易检测出痕量神经元特异性烯醇化酶(NSE),影响对小细胞肺癌(SCLC)检测的准确性。电化学免疫分析法(Electrochemical Immunoassay, ECIA)是将免疫技术与电化学检测结合的一种免疫分析新方法,基于抗原和抗体的特异性反应,将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上,通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量。电化学免疫分析的标记物主要有两类生物酶及电化学活性物质。用作标记物的电化学活性物质为具有电化学氧化还原性质的金属离子和电活性的有机功能基团。纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1 IOOnm)或由它们作为基本单元构成的材料,这大约相当于10 100个原子紧密排列在一起的尺度。由于纳米材料具有的高比表面积、高活性、特殊物理性质及小尺寸,使得纳米材料从一个惰性体转变为一个活泼的能提供电子和获取电子的物体,将其引入传感器的构建中可明显增强传感器的响应速度、灵敏度、选择性等。因此,提供一种灵敏度高、特异性好的基于复合纳米材料的电化学免疫检测方法用来检测神经元特异性烯醇化酶(NSE),对小细胞肺癌(SCLC)的早期诊断、病情监测、判断预后及其制定合理的治疗方案和评估疗效具有重要意义。

发明内容
有鉴于此,本发明提供一种基于Au-PB-SiO2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法。该检测方法采用双抗体夹心法,使固载在电极表面的神经元特异性烯醇化酶抗体与样品溶液中的神经元特异性烯醇化酶发生免疫反应,再和Au-PB-SiO2复合纳米颗粒与神经元特异性烯醇化酶抗体共耦合物结合。基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学活性,测得的循环伏安还原峰峰电流值与神经元特异性烯醇化酶浓度呈正相关,进而检测检测样品中神经元特异性烯醇化酶的浓度。为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案本发明提供了一种Au-PB-SiO2复合纳米颗粒的制备方法,将正硅酸乙酯加入乙醇和双蒸水的混合溶液中,超声处理后,滴加氨水溶液反应,离心收集沉淀,洗涤至PH值呈中性,制得含有SW2纳米颗粒的溶液;将I^eSO4和Kfe (CN) 6加入到所述含有SW2纳米颗粒的溶液中,离心收集沉淀,制得PB-SW2纳米颗粒;向所述PB-SiO2纳米颗粒中加入N- ( β -氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷溶液使所述PB-SiO2纳米颗粒表面氨基化,再加入金纳米颗粒溶液,制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒。作为优选,一种Au-PB-SW2复合纳米颗粒的制备方法,包含如下步骤步骤1 将2mL正硅酸乙酯(TEOS)加入IOmL乙醇和23mL双蒸水的混合溶液中, 超声处理,混勻,滴加5mL 25%的氨水溶液,在30°C下持续搅拌2h,6000rpm离心15min,弃上层清液,收集沉淀用乙醇和去离子水分别洗涤至PH值呈中性,制得含有SW2纳米颗粒的溶液;步骤2:将摩尔比为1 5的!^必04和K3Fe (CN)6W入到所述含有SiO2纳米颗粒的溶液中,室温下持续搅拌iai,6000rpm离心20min,弃上层清液,收集沉淀用乙醇和去离子水分别洗涤,制得含有PB-S^2纳米颗粒的溶液;步骤3 向所述含有PB-SiA纳米颗粒的溶液中加入N- ( β -氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷(APTEQ溶液,持续搅拌20 30min使PB-SiO2表面氨基功能化,加入含有金纳米颗粒的溶液(采用柠檬酸钠还原氯金酸法制得),使金纳米颗粒组装到PB-S^2复合纳米颗粒表面,制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒。纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1 IOOnm)或由它们作为基本单元构成的材料,这大约相当于10 100个原子紧密排列在一起的尺度。纳米材料所具有的高比表面积、高活性、特殊物理性质及小尺寸等特性使之成为非常有前景的传感器制备材料。由于纳米材料具有的大比表面、高表面,这使得纳米材料从一个惰性体转变为一个活泼的能提供电子和获取电子的物体,将其引入传感器的构建中,可明显增强传感器的响应速度、灵敏度、选择性等。正硅酸乙酯,是一种无色液体,分子式为C8H2tlO4Si,分子量为208. 33,在碱性环境下易水解生成S^2纳米颗粒。普鲁士蓝(PB)化学修饰电极最早出现于1978年,具有良好的氧化还原活性和易于制备等优点。研究发现,将PB纳米颗粒和其他有机或者无机材料复合,制成的PB复合纳米颗粒可有效增强PB纳米颗粒的稳定性。其中,采用化学掺杂技术,合成PB-SW2复合纳米颗粒,具有生物相容性好,稳定性好,利于进一步化学修饰等特点,在生物免疫传感分析方面具有重要价值。因此,本发明制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒,形成灵敏度高的电活性物质。作为优选,本发明通过!^eSO4和Kfe (CN)6合成普鲁士蓝(PB)。本发明将所述SW2纳米颗粒和普鲁士蓝(PB)结合,同时结合具有比表面积大、吸附力强、生物亲和性好等优点的金纳米粒子,所述的金纳米颗粒溶液采用柠檬酸钠还原氯金酸发制得。Ν-(β-氨乙基)_氨丙基三乙氧基硅烷(APTES),分子式为C11H2J2O3Si,分子量为沈4. 44,为偶联剂,可以在材料表面引入氨基。本发明向所述含有PB-SiO2纳米颗粒的溶液中加入Ν-(β-氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶液,持续搅拌20 -30min使 PB-SiO2表面氨基功能化,以便含有金纳米颗粒的溶液组装到PB-SW2复合纳米颗粒表面, 制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒。本发明还提供了上述制备方法制得的Au-PB-SW2复合纳米颗粒。本发明提供了一种电化学免疫检测方法,包括如下步骤步骤1 所述Au-PB-SW2复合纳米颗粒与待检蛋白抗体共耦合物的制备将所述 Au-PB-SiO2复合纳米颗粒加入到待检蛋白抗体溶液中,混勻后反应8 12h,加入封闭液温育,制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒与待检蛋白抗体共耦合物;步骤2 将玻碳电极抛光成镜面,超声处理,置于氯金酸溶液中,恒电位沉积,用二次水冲洗,置待检蛋白抗体溶液中浸泡吸附,封闭液温育,制得免疫电极;将所述免疫电极与含有不同浓度待检蛋白的标准品混合温育,用PBS冲洗,置于所述Au-PB-SW2复合纳米颗粒与待检蛋白抗体共耦合物中温育,制得工作电极;以所述工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极作为参比电极的三电极体系,在缓冲液中采用线性扫描伏安法进行电化学检测,以工作电极和免疫电极的响应电流值之差和标准品中待检蛋白的浓度绘制标准曲线;步骤3 如步骤2,将所述免疫电极与待检样品混合温育,进行电化学检测,测得待测样品的电化学峰峰电流强度,从标准曲线上读取对应的待检蛋白的浓度。为了除去非特异性结合位点,本发明采用封闭液牛血清白蛋白。为了保证充分结合,本发明选用温育的温度为20 40°C。为了保证充分结合,本发明选用温育的时间为40 120min。作为优选,所述缓冲液为0. lmol/L PBS(pH = 6-7)缓冲溶液。作为优选,所述线性扫描伏安法扫描范围为-0. 2 0. 6V,扫速为50mV/s。作为优选,本发明所述待检蛋白为肿瘤标志蛋白。肿瘤标志物(Tumor Marker)由肿瘤组织自身产生,可反映肿瘤存在和生长的一类生化物质,它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织,或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量,它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质,借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能,以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。主要有胚胎抗原、糖类抗原、天然自身抗原、细胞角蛋白、肿瘤相关的酶、激素以及某些癌基因等。肿瘤标志蛋白是由肿瘤组织自身产生,可反映肿瘤存在和生长的蛋白类物质。电化学免疫分析法(Electrochemical Immunoassay, ECIA)是将免疫技术与电化学检测结合的一种免疫分析新方法,基于抗原和抗体的特异性反应,将一些既易测定又具有高度敏感性的物质标记到特异性抗原或抗体分子上,通过这些标记物的增强放大效应来显示反应系统中抗原或抗体的性质与含量,兼有发光分析的高灵敏度和抗原抗体反应的高度特异性。因此,本发明提供的电化学检测方法可以通过抗原抗体的特异性反应,用来检测肿瘤标志蛋白。优选地,所述肿瘤标志蛋白包括胃泌素前体释放肽、神经元特异性烯醇化酶、 CYFRA21-U AFP、APT、CEA、CA242、CA125、CA199、CA153、CA724、CA50、f-PSA、t_PSA、 Free β-hCG、SCCA, β2-MG。肿瘤标志蛋白按照肿瘤组织产生不同,包括分化抗原;胚胎抗原(AFP,CEA);同工酶(NSE);激素(HCG);组织特异性抗原(PSA,free PSA);粘蛋白、糖蛋白、糖脂(CA125);电化学发光仪上常可检验一下标志物AFP、CEA、CA199、CA724、CA125、CA153、NSE、Cyfra21-l、 PSA、free PSA。AFP、APT :主要相关肿瘤肝细胞癌和生殖细胞癌;其它相关肿瘤胚胎细胞癌、卵巢畸胎瘤、胃癌、胆道癌、胰腺癌等。CEA 主要相关肿瘤广谱的肿瘤标志物;其它相关肿瘤常见于肺癌、大肠癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、甲状腺髓样癌等。CA242 主要相关肿瘤胰腺癌、胃、结肠癌;其它相关肿瘤肝癌、食管癌、肺癌。CA125 主要相关肿瘤卵巢癌;其它相关肿瘤肺癌、胰腺癌、乳腺癌、肝癌、胃肠道恶性肿瘤、子宫癌。CA199 主要相关肿瘤胰腺癌、胆管癌、结直肠癌;其它相关肿瘤肝癌、胆囊癌、 胆管癌等。CA153 主要相关肿瘤乳腺癌的首选标志物;其它相关肿瘤肺癌、卵巢癌、肺腺癌、结直肠癌等均可增高。CA724 主要相关肿瘤胃癌的最佳肿瘤标志物之一;其它相关肿瘤对其他胃肠道癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等也有不同检出率。CA50 主要相关肿瘤胰腺和结、直肠癌的标志物;其它相关肿瘤胃癌、胆囊癌、 肝癌、肺癌、乳腺癌。NSE、胃泌素前体释放肽主要相关肿瘤小细胞肺癌;其它相关肿瘤肺腺癌、大细胞肺癌。CYFRA21-1 主要相关肿瘤肺鳞癌、宫颈癌、食管癌;其它相关肿瘤膀胱癌、鼻咽癌、卵巢癌、胃肠道癌。f-PSA 主要相关肿瘤前列腺癌;其它相关肿瘤某些妇科肿瘤和乳腺癌。t-PSA 主要相关肿瘤前列腺癌;其它相关肿瘤某些妇科肿瘤、多囊卵巢综合症、乳腺癌。Free^-hCG 主要相关肿瘤妇科肿瘤和非精原性睾丸癌;其它相关肿瘤乳腺癌、精原性睾丸癌、肺癌、肝癌等。SCCA 主要相关肿瘤宫颈鳞癌;其它相关肿瘤肺鳞癌、头颈部鳞癌、食管癌以及外阴部鳞状细胞癌等。β 2-MG 主要相关肿瘤恶性肿瘤辅助性标志物,慢性淋巴细胞白血病、淋巴细胞肉瘤、多发性骨髓瘤等尤为明显。其它相关肿瘤肺癌、乳腺癌、胃肠道癌及子宫颈癌中也可
6见升高。优选地,所述待检蛋白为神经元特异性烯醇化酶。作为优选,本发明提供了一种电化学免疫检测方法,包括如下步骤步骤1 所述Au-PB-SW2复合纳米颗粒与神经元特异性烯醇化酶抗体共耦合物的制备取80 120 μ L的神经元特异性烯醇化酶抗体,缓慢加入到80 120 μ L mol/L的含有所述Au-PB-SW2复合纳米颗粒的溶液中,充分混勻后在4°C下持续搅拌8 12h,加入 50 μ L 0.25%的牛血清白蛋白溶液以封闭多层结构的Au-PB-SiO2纳米了颗粒上的非特异性结合位点,并在25°C下温育反应1 2h,制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒与神经元特异性烯醇化酶抗体共耦合物,所得产物保存于4°C ;步骤2 将玻碳电极(Φ = 4mm)抛光成镜面,超声清洗干净,晾干,置于1 %的氯金酸(HAuCl4)溶液中,在-0. 2V下恒电位沉积30 50s,用二次水冲洗干净,晾干,清洗后将电沉积了纳米金的修饰电极置于神经元特异性烯醇化酶抗体溶液中,于4°C浸泡吸附他, 取出水洗,置于0. 25% BSA溶液中,37°C温育lh,取出水洗,制得免疫电极;将所述免疫电极分别与80 120 μ L神经元特异性烯醇化酶标准溶液,于37。C反应30min,用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品,置于80 120 μ L Au-PB-SiO2复合纳米颗粒与检测抗体共耦合物溶液中,在37°C下反应30min,用PBS溶液洗涤,以除去非特异性吸咐的共耦合物制得工作电极。采用三电极体系,所述工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,在0. lmol/L PBS (pH = 6-7)缓冲溶液中,进行电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学检测,以工作电极和免疫电极的响应电流值之差和标准品中待检蛋白的浓度绘制标准曲线;步骤3 如步骤2,将所述免疫电极与待检样品混合温育,进行电化学检测,测得待测样品的电化学峰峰电流强度,从标准曲线上读取对应的待检蛋白的浓度。本发明公开了一种基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法。该检测方法采用双抗体夹心法,使固载在电极表面的神经元特异性烯醇化酶抗体与样品溶液中的神经元特异性烯醇化酶发生免疫反应,再和Au-PB-SiO2复合纳米颗粒与神经元特异性烯醇化酶抗体共耦合物结合。基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学活性,测得的循环伏安还原峰峰电流值与神经元特异性烯醇化酶浓度呈正相关,进而检测检测样品中神经元特异性烯醇化酶的浓度。本发明提供的电化学免疫检测方法线性响应范围为0. 25 500ng/mL, 检测下限为0.08ng/mL,特异性好,灵敏度高,对小细胞肺癌(SCLC)的诊断具有重要意义。


图1示实施例4中基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法制得的神经元特异性烯醇化酶(NSE)标准曲线,横坐标为神经元特异性烯醇化酶(NSE)标准品的浓度,单位为ng/mL ;纵坐标为检测得到峰电流均值,单位为μ A。图2示实施例5中基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法制得的神经元特异性烯醇化酶(NSE)标准曲线,横坐标为神经元特异性烯醇化酶(NSE)标准品的浓度,单位为ng/mL ;纵坐标为检测得到峰电流均值,单位为μ A。图3示实施例6中基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法制得的神经元特异性烯醇化酶(NSE)标准曲线,横坐标为神经元特异性烯醇化酶(NSE)标准品的浓度,单位为ng/mL ;纵坐标为检测得到峰电流均值,单位为μ A。
具体实施例方式本发明公开了一种基于Au-PB-SiO2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。下面结合实施例,进一步阐述本发明本发明中,Ν-(β-氨乙基)_氨丙基三乙氧基硅烷(APTEQ、FeS04、K3Fe (CN)6、正硅酸乙酯(TEOS)、氯金酸(HAuCl4)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经元特异性烯醇化酶抗体(anti-NSE)均购自美国Sigma公司;人体血清样品均来自第三军医大学第三附属医院肿瘤中心,检测组(患者血清)216名,其中男108名,女108名;对照组(正常人血清)100 名,其中男50名,女50名。 实施例1制备Au-PB-SW2复合纳米颗粒将2mL正硅酸乙酯(TEOS)加入IOmL乙醇和23mL双蒸水的混合溶液中,超声处理, 混勻,滴加5mL 25%的氨水溶液,在30°C下持续搅拌池,6000rpm离心15min,弃上层清液, 收集沉淀用乙醇和去离子水分别洗涤至PH值呈中性,制得含有SW2纳米颗粒的溶液;将摩尔比为1 5的!^SO4和Kfe (CN)6W入到所述含有SiO2纳米颗粒的溶液中,室温下持续搅拌1 !,6000ι·ρπι离心20min,弃上层清液,收集沉淀用乙醇和去离子水分别洗涤,制得含有 PB-SiO2纳米颗粒的溶液;向所述含有PB-SW2纳米颗粒的溶液中加入N- ( β -氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷(APTEQ溶液,持续搅拌20min使PB-SW2表面氨基功能化,加入含有金纳米颗粒的溶液(采用柠檬酸钠还原氯金酸法制得),使金纳米颗粒组装到PB-S^2复合纳米颗粒表面,制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒。实施例2制备Au-PB-SW2复合纳米颗粒将2mL正硅酸乙酯(TEOS)加入IOmL乙醇和23mL双蒸水的混合溶液中,超声处理, 混勻,滴加5mL 25%的氨水溶液,在30°C下持续搅拌池,6000rpm离心15min,弃上层清液, 收集沉淀用乙醇和去离子水分别洗涤至PH值呈中性,制得含有SW2纳米颗粒的溶液;将摩尔比为1 5的!^SO4和Kfe (CN)6W入到所述含有SiO2纳米颗粒的溶液中,室温下持续搅拌1 !,6000ι·ρπι离心20min,弃上层清液,收集沉淀用乙醇和去离子水分别洗涤,制得含有 PB-SiO2纳米颗粒的溶液;向所述含有PB-SW2纳米颗粒的溶液中加入N- ( β -氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷(APTEQ溶液,持续搅拌30min使PB-SW2表面氨基功能化,加入含有金纳米颗粒的溶液(采用柠檬酸钠还原氯金酸法制得),使金纳米颗粒组装到PB-S^2复合纳米颗粒表面,制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒。实施例3制备Au-PB-SW2复合纳米颗粒将2mL正硅酸乙酯(TEOS)加入IOmL乙醇和23mL双蒸水的混合溶液中,超声处理, 混勻,滴加5mL 25%的氨水溶液,在30°C下持续搅拌池,6000rpm离心15min,弃上层清液, 收集沉淀用乙醇和去离子水分别洗涤至PH值呈中性,制得含有SW2纳米颗粒的溶液;将摩尔比为1 5的!^SO4和Kfe (CN)6W入到所述含有SiO2纳米颗粒的溶液中,室温下持续搅拌1 !,6000ι·ρπι离心20min,弃上层清液,收集沉淀用乙醇和去离子水分别洗涤,制得含有 PB-SiO2纳米颗粒的溶液;向所述含有PB-SW2纳米颗粒的溶液中加入N- ( β -氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷(APTEQ溶液,持续搅拌25min使PB-SW2表面氨基功能化,加入含有金纳米颗粒的溶液(采用柠檬酸钠还原氯金酸法制得),使金纳米颗粒组装到PB-S^2复合纳米颗粒表面,制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒。实施例4基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)Au-PB-SiO2复合纳米颗粒与神经元特异性烯醇化酶抗体共耦合物的制备取 80 μ L的神经元特异性烯醇化酶抗体,缓慢加入到100 μ L mol/L的含有实施例1制备的 Au-PB-SiO2复合纳米颗粒的溶液中,充分混勻后在4°C下持续搅拌8h,加入50 μ L 0. 25% 的牛血清白蛋白溶液以封闭多层结构的Au-PB-SW2纳米颗粒上的非特异性结合位点,并在 25°C下温育反应lh,制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒与神经元特异性烯醇化酶抗体共耦合物,所得产物保存于4°C ;免疫电极的制备将玻碳电极(Φ = 4mm)抛光成镜面,超声清洗干净,晾干,置于 1 %的氯金酸(HAuCl4)溶液中,在-0. 2V下恒电位沉积30s,用二次水冲洗干净,晾干,清洗后将电沉积了纳米金的修饰电极置于神经元特异性烯醇化酶抗体溶液中,于4°C浸泡吸附他,取出水洗,置于0. 25% BSA溶液中,37°C温育lh,取出水洗,制得免疫电极;工作电极的制备将免疫电极分别与80 μ L 0. 25,0. 5,0. 75,1.0,2. 5,10,50, 100,500ng/mL的神经元特异性烯醇化酶标准溶液,于37°C反应30min,用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品,置于80μ L Au-PB-SiO2复合纳米颗粒与检测抗体共耦合物溶液中,在37°C 下反应30min,用PBS溶液洗涤,以除去非特异性吸咐的共耦合物。电化学检测采用三电极体系,所述工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,在0. lmol/L PBS(pH = 6. 86)缓冲溶液中,进行电位扫描速度为 50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学检测。进行三次循环伏安扫描,记录下三次扫描得到的还原峰电流值。测得的循环伏安还原峰峰电流值随神经元特异性烯醇化酶 (NSE)的浓度增加而增强,电流变化与神经元特异性烯醇化酶(NSE)成正比。以神经元特异性烯醇化酶(NSE)标准溶液的浓度为横坐标,将三次循环伏安扫描得到的以工作电极和免疫电极的还原峰电流值之差求平均值作纵坐标,制作标准曲线,如图1,标准曲线方程为 I = 5. 262LogCNSE+2. 138。基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法检测人血清样品中神经元特异性烯醇化酶(NSE)人体血清样品均来自第三军医大学第三附属医院肿瘤中心,检测组(患者血清)216名,其中男108名,女108名;对照组(正常人血清)100名,其中男50名,女50名。将免疫电极分别与80 μ L血清样品溶液,于37。C反应30min,反应完成后用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品,再置于80 μ L Au-PB-SiO2复合纳米颗粒与检测抗体共耦合物溶液中,在37°C下反应30min。用PBS溶液洗3次,以除去非特异性吸咐的共耦合物,制得所述工作电极。电化学检测采用三电极体系,工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极 (SCE)作为参比电极。在0. lmol/L PBS (pH = 6. 86)缓冲溶液中进行,采用电位扫描速度为 50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学对免疫电极进行三次循环伏安扫描,并记录下三次扫描得到的还原峰电流值,并与标准曲线比较,得到对应的神经元特异性烯醇化酶(NSE)的浓度。实施例5基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法检测神经元特异性烯醇化酶(NSE)Au-PB-SiO2复合纳米颗粒与神经元特异性烯醇化酶抗体共耦合物的制备取 100 μ L的神经元特异性烯醇化酶抗体,缓慢加入到80 μ L mol/L的含有实施例2制备的 Au-PB-SiO2复合纳米颗粒的溶液中,充分混勻后在4°C下持续搅拌10h,加入50μ L 0. 25% 的牛血清白蛋白溶液以封闭多层结构的Au-PB-SW2纳米颗粒上的非特异性结合位点,并在 25°C下温育反应1. 5h,制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒与神经元特异性烯醇化酶抗体共耦合物,所得产物保存于4°C ;免疫电极的制备将玻碳电极(Φ = 4mm)抛光成镜面,超声清洗干净,晾干,置于 1 %的氯金酸(HAuCl4)溶液中,在-0. 2V下恒电位沉积40s,用二次水冲洗干净,晾干,清洗后将电沉积了纳米金的修饰电极置于神经元特异性烯醇化酶抗体溶液中,于4°C浸泡吸附他,取出水洗,置于0. 25% BSA溶液中,37°C温育lh,取出水洗,制得免疫电极;工作电极的制备将免疫电极分别与100 μ L神经元特异性烯醇化酶标准溶液,于 37°C反应30min,用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品,置于100 μ LAu-PB-SW2复合纳米颗粒与检测抗体共耦合物溶液中,在37°C下反应30min,用PBS溶液洗涤,以除去非特异性吸咐的共耦合物。电化学检测采用三电极体系,所述工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,在0. lmol/L PBS(pH = 6. 0)缓冲溶液中,进行电位扫描速度为 50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学检测。进行三次循环伏安扫描,记录下三次扫描得到的还原峰电流值。测得的循环伏安还原峰峰电流值随神经元特异性烯醇化酶 (NSE)的浓度增加而增强,电流变化与神经元特异性烯醇化酶(NSE)成正比。以神经元特异性烯醇化酶(NSE)标准溶液的浓度为横坐标,将三次循环伏安扫描得到的以工作电极和免疫电极的还原峰电流值之差求平均值作纵坐标,制作标准曲线,如图2,标准曲线方程为 I = 5. 902LogCNSE+2. 16。基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法检测人血清样品中神经元特异性烯醇化酶(NSE)人体血清样品均来自第三军医大学第三附属医院肿瘤中心,检测组(患者血清)216名,其中男108名,女108名;对照组(正常人血清)100名,其中男50名,女50名。将免疫电极分别与100 μ L血清样品溶液,于37°C反应30min,反应完成后用PBS 冲洗去掉未结合的蛋白样品,再置于100 μ L Au-PB-SiO2复合纳米颗粒与检测抗体共耦合物溶液中,在37°C下反应30min。用PBS溶液洗3次,以除去非特异性吸咐的共耦合物,制得所述工作电极。电化学检测采用三电极体系,工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极。在0. lmol/L PBS(pH = 6. 86)缓冲溶液中进行,采用电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学对免疫电极进行三次循环伏安扫描,并记录下三次扫描得到的还原峰电流值,并与标准曲线比较,得到对应的神经元特异性烯醇化酶(NSE)的浓度。实施例6基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法检测神经元特异
10性烯醇化酶(NSE)Au-PB-SiO2复合纳米颗粒与神经元特异性烯醇化酶抗体共耦合物的制备取 120 μ L的神经元特异性烯醇化酶抗体,缓慢加入到120 μ L mol/L的含有实施例3制备的 Au-PB-SiO2复合纳米颗粒的溶液中,充分混勻后在4°C下持续搅拌12h,加入50 μ L 0. 25% 的牛血清白蛋白溶液以封闭多层结构的Au-PB-SW2纳米颗粒上的非特异性结合位点,并在 25°C下温育反应2h,制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒与神经元特异性烯醇化酶抗体共耦合物,所得产物保存于4°C ;免疫电极的制备将玻碳电极(Φ = 4mm)抛光成镜面,超声清洗干净,晾干,置于 1 %的氯金酸(HAuCl4)溶液中,在-0. 2V下恒电位沉积50s,用二次水冲洗干净,晾干,清洗后将电沉积了纳米金的修饰电极置于神经元特异性烯醇化酶抗体溶液中,于4°C浸泡吸附他,取出水洗,置于0. 25% BSA溶液中,37°C温育lh,取出水洗,制得免疫电极;工作电极的制备将免疫电极分别与120 μ L神经元特异性烯醇化酶标准溶液,于 37°C反应30min,用PBS冲洗去掉未结合的蛋白样品,置于120 μ LAu-PB-SW2复合纳米颗粒与检测抗体共耦合物溶液中,在37°C下反应30min,用PBS溶液洗涤,以除去非特异性吸咐的共耦合物。电化学检测采用三电极体系,所述工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极,在0. lmol/L PBS(pH = 7. 0)缓冲溶液中,进行电位扫描速度为 50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学检测。进行三次循环伏安扫描,记录下三次扫描得到的还原峰电流值。测得的循环伏安还原峰峰电流值随神经元特异性烯醇化酶 (NSE)的浓度增加而增强,电流变化与神经元特异性烯醇化酶(NSE)成正比。以神经元特异性烯醇化酶(NSE)标准溶液的浓度为横坐标,将三次循环伏安扫描得到的以工作电极和免疫电极的还原峰电流值之差求平均值作纵坐标,制作标准曲线,如图3,标准曲线方程为 I = 5. 79LogCNSE+2. 06。基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法检测人血清样品中神经元特异性烯醇化酶(NSE)人体血清样品均来自第三军医大学第三附属医院肿瘤中心,检测组(患者血清)216名,其中男108名,女108名;对照组(正常人血清)100名,其中男50名,女50名。将免疫电极分别与120 μ L血清样品溶液,于37°C反应30min,反应完成后用PBS 冲洗去掉未结合的蛋白样品,再置于120 μ L Au-PB-SiO2复合纳米颗粒与检测抗体共耦合物溶液中,在37°C下反应30min。用PBS溶液洗3次,以除去非特异性吸咐的共耦合物,制得所述工作电极。电化学检测采用三电极体系,工作电极,钼丝电极作为对电极,饱和甘汞电极(SCE)作为参比电极。在0. lmol/L PBS(pH = 6. 86)缓冲溶液中进行,采用电位扫描速度为50mV/s,扫描范围为-0. 2 0. 6V的循环伏安电化学对免疫电极进行三次循环伏安扫描,并记录下三次扫描得到的还原峰电流值,并与标准曲线比较,得到对应的神经元特异性烯醇化酶(NSE)的浓度。实施例7基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法与ELISA检测方法的比较人体血清样品均来自第三军医大学第三附属医院肿瘤中心,检测组(患者血清)216名,其中男108名,女108名;对照组(正常人血清)100名,其中男50名,女50名。
ELISA检测神经元特异性烯醇化酶(NSE) =ELISA试剂盒购自上海锐谷生物科技有限公司与实施例4至6中基于Au-PB-SW2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法的检测结果比较,血清样品为检测组患者血清,共216个样本,其中男性患者108名,女性患者108 名,平均分为18组,每组血清样本6个,男性女性血清样本各3个,结果见表1。表1电化学免疫检测方法与ELISA检测方法的结果
权利要求
1.一种Au-PB-SiA复合纳米颗粒的制备方法,其特征在于,将正硅酸乙酯加入乙醇和双蒸水的混合溶液中,超声处理后,制得含有SiA纳米颗粒的溶液;将I^eSO4和Kfe (CN) 6加入到所述含有SW2纳米颗粒的溶液中,制得PB-SiA纳米颗粒;向所述PB-SiA纳米颗粒中加入N-( β -氨乙基)-氨丙基三乙氧基硅烷溶液使所述PB-SiA纳米颗粒表面氨基化,再加入金纳米颗粒溶液,制得Au-PB-SW2复合纳米颗粒。
2.如权利要求1所述的制备方法制得的Au-PB-SW2复合纳米颗粒。
3.一种电化学免疫检测方法,其特征在于,包括如下步骤步骤1 制备如权利要求2所述的Au-PB-SW2复合纳米颗粒与待检蛋白抗体共耦合物;步骤2:将玻碳电极预处理,置待检蛋白抗体溶液中充分结合,封闭以除去非特异性结合位点,制得免疫电极;将所述免疫电极与含有不同浓度待检蛋白的标准品充分结合,除去非特异性结合位点,置于所述Au-PB-SW2复合纳米颗粒与待检蛋白抗体共耦合物中充分结合,制得工作电极;在缓冲液中采用线性扫描伏安法进行电化学检测,以工作电极和免疫电极的响应电流值之差和标准品中待检蛋白的浓度绘制标准曲线;步骤3 如步骤2,将所述免疫电极与待检样品混合温育,进行电化学检测,测得待测样品的电化学峰峰电流强度,从所述标准曲线上读取对应的待检蛋白的浓度。
4.如权利要求3所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,所述玻碳电极预处理包括将所述玻碳电极抛光成镜面,超声处理后置于氯金酸溶液中,恒电位沉积。
5.如权利要求3所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,所述缓冲液为ρΗ值为6 7的PBS缓冲溶液。
6.如权利要求3所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,所述线性扫描伏安法扫描范围为-0. 2 0. 6V,扫速为50mV/s。
7.如权利要求1至6任一项所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,所述待检蛋白为肿瘤标志蛋白。
8.如权利要求7所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,所述肿瘤标志蛋白包括胃泌素前体释放肽、神经元特异性烯醇化酶、CYFRA21-1、AFP、APT、CEA、CA242, CA125、CA199、 CA153、CA724、CA50、f-PSA、t_PSA、Free β -hCG、SCCA, β 2-MG。
9.如权利要求8所述的电化学免疫检测方法,其特征在于,所述待检蛋白为神经元特异性烯醇化酶。
全文摘要
本发明公开了一种基于Au-PB-SiO2复合纳米颗粒的电化学免疫检测方法。该检测方法采用双抗体夹心法,使固载在电极表面的神经元特异性烯醇化酶抗体与样品溶液中的神经元特异性烯醇化酶发生免疫反应,再和Au-PB-SiO2复合纳米颗粒与神经元特异性烯醇化酶抗体共耦合物结合。基于Au-PB-SiO2复合纳米颗粒的电化学活性,测得的循环伏安还原峰峰电流值与神经元特异性烯醇化酶浓度呈正相关,进而检测待测样品中神经元特异性烯醇化酶的浓度。本发明提供的电化学免疫检测方法线性相应范围为0.25~500ng/ml,检测下限为0.08ng/ml,特异性好,灵敏度高,对小细胞肺癌(SCLC)的诊断具有重要意义。
文档编号B82Y40/00GK102226807SQ20111007584
公开日2011年10月26日 申请日期2011年3月28日 优先权日2011年3月28日
发明者仲召阳, 关伟, 卿毅, 戴楠, 李梦侠, 王东 申请人:中国人民解放军第三军医大学第三附属医院


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